La scena dell'Adorazione dei Magi venne interpretata in chiave moderna, all'avanguardia rispetto alle recenti innovazioni introdotte da Sandro Botticelli (Adorazione di Santa Maria Novella, 1475 circa) e Leonardo da Vinci (Adorazione degli Uffizi, 1481-1482). la Madonna si trova infatti al centro di una composizione piramidale col Bambino mostrato ai Magi e agli astanti. Alla base della piramide si trovano due dei Magi, uno nell'atto di baciare un piedino del bimbo, uno inginocchiato con una mano sul petto, mentre il terzo si trova in piedi sulla sinistra, caratterizzato da un manto giallo e rosso, e ritratto mentre porge in dono un ricco calice[3]. Essi, come di solito, rappresentano tre diverse età dell'uomo: giovinezza, maturità e vecchiaia. Ai loro lati stanno, in posizione accovacciata, san Giovanni Battista, che guarda lo spettatore e, come di consueto, indica il Bambino, e san Giovanni Evangelista, che presenta un fanciullo ferito alla Madonna; un altro fanciullino, evidente richiamo agli orfani "innocenti" dell'istituzione, si trova sul lato opposto. A essi fa riferimento anche la strage degli innocenti rappresentata sullo sfondo, a sinistra[4]]. Le loro figure sono delicate e poetiche, cariche del senso infantile del loro semplice omaggio al santo Bambino[5].

Attorno alla Vergine si trovano il bue e l'asinello, oltre a san Giuseppe, che veglia sul bambino, guardandolo. La capanna è composta da un muro in mattoni incompiuto, simboleggiante il paganesimo in declino da cui nacque il cristianesimo; da essa si levano quattro pilastri all'antica decorati da candelabre e capitelli corinzi dorati, che reggono un semplice tetto di paglia a spioventi. Su di esso quattro angeli reggono un cartiglio con un tetragramma che riporta le note e le prime parole del Gloria, come a invitare lo spettatore a unirsi nel canto[6].

Sempre in primo piano si trovano a sinistra alcuni astanti, tra cui in secondo piano si riconoscono il committente, vestito di nero, e l'artista, che guarda verso lo spettatore. A destra invece si trovano tre personaggi del corteo dei Magi riccamente abbigliati, che dovrebbero rappresentare i membri della potente Arte della Seta, finanziatrice principale dell'Istituto. Sopra di loro il corteo si dispiega in lontananza, passando sotto un arco, altro riferimento alla transizione dal mondo pagano, sul cui fregio è riportata la data MCCCCLXXXVIII (1488). A un esame attento si nota che i cinque cavalli sono stati realizzati a partire da due soli cartoni, poi colorati diversamente e con qualche piccola variante: uno con al testa girata a sinistra (cavalli bianco e baio in primo piano) e uno con la testa girata a destra (gli altri). Sullo sfondo, da questa parte, si vede poi l'annuncio ai pastori da parte di un angelo che vola in un nimbo luminoso. Dietro la Vergine infine, stagliati sullo sfondo di un paesaggio lacustre solcato da navi tra svettanti colline e montagne, si affacciano a contemplare la scena un personaggio laico e uno religioso, simboleggianti i principali artefici dell'opera assistenziale dell'orfanotrofio.

La città sullo sfondo è una rappresentazione simbolica di Roma: si riconoscono infatti il Colosseo, la Colonna Traiana, la Torre delle Milizie e la Piramide Cestia.